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1． 前言

采用經(jīng)典的逐步合成，由于肽鏈延長，偶合效率會大大下降導(dǎo)致合成產(chǎn)品純度很低，而采用CSPPS，可以合成復(fù)雜或者困難的多肽，甚至是小蛋白。CSPPS在合成保護(hù)多肽片段過程中，可以選擇固相也可以選擇液相，但都涉及選擇氨基酸保護(hù)策略以及多肽合成樹脂，一般合成都采用CLTR樹脂和Fmoc氨基酸。

2． 固相合成多肽片段

2.1．片段選擇

由于片段縮合過程中采用片段活化方法進(jìn)行連接，因此可能產(chǎn)生的消旋化會比但個氨基酸困難多了，但是在合成一些有可能產(chǎn)生β折疊的困難多肽中，采用片段合成會大大提高縮合效率，因為我們可以選擇斷裂β折疊結(jié)構(gòu)的兩個片段，由于采用N到C端的方法仍然處于探索階段，現(xiàn)在仍然以C到N端為主。考慮合成片段本身的純度，一般片段選擇在15個氨基酸以內(nèi)的肽段，因為這樣肽段純化相對比較容易。另外考慮片段合成消旋及最后產(chǎn)率，對C端，N端的氨基酸選擇有一些經(jīng)驗可以借鑒，如在C端，采用G、P、K（BOC）、E（OTBU）比較多點，N端選擇G、A、D（OTBU）、K（BOC）、S（TBU）比較多點。當(dāng)然縮合效率與樹脂的性質(zhì)也有很大關(guān)系，而且一般認(rèn)為N-端比C端影響更大。

2.2．合成肽段

2.2.1．采用CLTR樹脂合成，反應(yīng)速度快，產(chǎn)率高，而且沒有消旋化，在Fmoc氨基酸連接到CLTR上的時候，必須迅速將Fmoc脫去，一般分為兩步，先用25% 哌啶/DMF，脫3min，在脫20min。免得導(dǎo)致將氨基酸從樹脂上切割下來。合成后脫除了Fmoc之后，可以采用HBTU/HOBT/DIEA（1/1/2）接入第二個Fmoc氨基酸，一般不采用DIC（DCC）/HOBT方法，因為該方法回導(dǎo)致0.5-2.5%的三肽形成，這個主要是生成的二肽從樹脂上切割下來重新連接到樹脂上所生成的，以后的合成適用各種合成方法。

2.2.2．切割方法

將肽段從CLTR樹脂上切割下來，可以采用的方法很多。

2.2.3．純化方法

由于一般合成多肽的極性相當(dāng)?shù)?，采?/span>C8，0.5% TFA，檢測波長265nm，純化中需要采用較高的ACN起始濃度，而且一般采用等度洗脫。也可以通過合成中引入側(cè)鏈沒保護(hù)的N，Q，增加極性，或者采用S（Trt）、T（Trt），Y（Clt），這些保護(hù)基團(tuán)在切割后可以同時脫除，也起到增加極性的目的。

1． 固相片段縮合

3.1．C端肽段連接到樹脂

雖然可以直接按照逐步合成先在CLTR上合成一個肽段，但是可能出現(xiàn)每步合成效率不夠高，而導(dǎo)致合成肽鏈不純，因此，有中方法就是將合成并純化好的肽段連接到CLTR樹脂上，考慮合成肽段比較昂貴，一般只采用1-1.5倍過量的肽段進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)可以采用HPLC監(jiān)測，反應(yīng)結(jié)束后也要脫Fmoc，5% 哌啶/DMF，5min，再用25%哌啶/DMF，20min。然后依次用DMF，DMSO，ISOPROPANOL，HEXANE洗滌，真空干燥，放置-20℃保存。

3.2．活化及縮合多肽片段

在縮合肽段過程中，溶劑，縮合試劑選擇對減少消旋，提高產(chǎn)品純度有重要作用。采用通常的BOP，HBTU，TBTU，HATU，產(chǎn)生的消旋化程度非常高，達(dá)70-90%，而且采用DMF為溶劑，長時間的反應(yīng)還會引起Fmoc的脫落，而采用DMSO為溶劑，消旋可以降低到1%，DCC（DIC）/HOBt（DhbtOH）縮合方法要優(yōu)越。一般反應(yīng)時間不超過6h，如果6h還不能檢測通過，在縮合一次。連接之后，反應(yīng)結(jié)束后也要脫Fmoc，5% 哌啶/DMF，5min，再用25%哌啶/DMF，20min。然后依次用DMF，DMSO，ISOPROPANOL，HEXANE洗滌，真空干燥，放置-20℃保存。

2． 液相片段縮合

4.1．液相片段縮合

CSPPS，盡管可以通過選擇肽段，保護(hù)基，縮合方法，仍然有一些肽段無法通過該方法合成，而采用液相片段縮合可以完成，而且價格也比較便宜。液相合成一般先合成片段，并將其中一個片段與2-chlorotrityl chloride反應(yīng)生成2-chlorotrityl esters，再用4% 哌啶/DMF/THF，室溫下反應(yīng)2h。反應(yīng)結(jié)束后，2-chlorotrityl esters可以用TFE/DCM（3/7）反應(yīng)45min。如果其中一個片段是酰胺化的，采用DIC/HOBt·NH₃，DMSO為溶劑反應(yīng)可以完成酰胺化。

4.2．雙向合成——采用氨基酸側(cè)鏈連接CLTR樹脂

CSPPS合成過程中，采用CLTR樹脂，Fmoc-氨基酸，通常采用H（Mmt）、C（Mmt）、K（Mtt）、S（Trt）。其它氨基酸都采用tBu保護(hù)，采用1% TFA切割，可以同時脫去上面幾個氨基酸的側(cè)鏈保護(hù)基，而且不影響H（Trt），C（Trt）。4-methoxytrityl chloride 樹脂用于H，C；2-chlorotrityl chloride樹脂用于K，S。

3． 切割，純化已經(jīng)純度確定

在合成大肽過程中，切割一般采用三步切割方案：先將Fmoc-肽段從CLTR上切割下來；用65% TFA/DCM/EDT（95/5），室溫下1h，溶劑蒸發(fā)后，乙醚沉淀；用TFA/H2O/EDT（90/5/5）反應(yīng)4h，去掉所有Pmc，Pbf，在濃縮，乙醚沉淀，RP-HPLC純化，在用5% 哌啶/水 脫N端Fmoc，時間1-2h，混合溶液用10% 醋酸酸化，乙醚萃取掉Fmoc脫出產(chǎn)物，凍干后，用RP-HPLC分離純化。